Executar o Sentieon® DNASeq®

Nesta página, explicamos como executar o Sentieon® DNASeq® como um pipeline do Google Cloud para análise genômica secundária. O pipeline classifica os seguintes resultados com base nas práticas recomendadas do Genome Analysis Toolkit (GATK) versão 3.7:

• Alinhamento
• Classificação
• Remoção duplicada
• Recalibragem do índice de qualidade básico (BQSR, na sigla em inglês)
• Chamada de variantes

Veja abaixo alguns dos formatos de entrada:

• Arquivos fastq
• Arquivos BAM alinhados e classificados

Objetivos

Depois de concluir este tutorial, você saberá:

• como executar um pipeline no Google Cloud usando o Sentieon® DNASeq®;
• como gravar arquivos de configuração para diferentes casos de uso do Sentieon® DNASeq®.

Custos

Neste documento, você usará os seguintes componentes faturáveis do Google Cloud:

• Compute Engine
• Cloud Storage

Para gerar uma estimativa de custo baseada na projeção de uso deste tutorial, use a calculadora de preços. Novos usuários do Google Cloud podem estar qualificados para uma avaliação gratuita.

Antes de começar

1. Instale o Python versão 2.7 ou posterior (em inglês). Para mais informações sobre como configurar o ambiente de desenvolvimento Python, como instalar o pip no sistema, consulte o Guia de configuração do ambiente de desenvolvimento Python.
2. Sign in to your Google Cloud account. If you're new to Google Cloud, create an account to evaluate how our products perform in real-world scenarios. New customers also get $300 in free credits to run, test, and deploy workloads.

3. In the Google Cloud console, on the project selector page, select or create a Google Cloud project.

   Go to project selector

4. Make sure that billing is enabled for your Google Cloud project.

5. Enable the Cloud Life Sciences, Compute Engine, and Cloud Storage APIs.

   Enable the APIs

6. In the Google Cloud console, on the project selector page, select or create a Google Cloud project.

   Go to project selector

7. Make sure that billing is enabled for your Google Cloud project.

8. Enable the Cloud Life Sciences, Compute Engine, and Cloud Storage APIs.

   Enable the APIs

9. Install the Google Cloud CLI.

10. To initialize the gcloud CLI, run the following command:

    gcloud init

11. Update and install gcloud components:

    gcloud components update
    gcloud components install beta

12. Instale o git para fazer o download dos arquivos necessários.

    Fazer o download do git

13. Por padrão, o Compute Engine tem cotas de recursos para impedir o uso inadvertido. Ao aumentar as cotas, você pode iniciar mais máquinas virtuais simultaneamente, aumentando a capacidade e reduzindo o tempo de retorno.

    Para os melhores resultados neste tutorial, você precisa solicitar mais cota acima do padrão do seu projeto. Veja recomendações para aumentos de cota na lista a seguir, além das cotas mínimas necessárias para executar o tutorial. Faça as solicitações de cota na região us-central1:

    • CPUs: 64
    • disco permanente padrão (GB): 375

    É possível deixar outros campos de solicitação de cota vazios para manter suas cotas atuais.

Licença de avaliação do Sentieon®

Ao usar esse pipeline, o Sentieon® concede automaticamente uma licença de avaliação gratuita do software de duas semanas para usar com o Google Cloud. Para receber a licença, insira seu endereço de e-mail no campo EMAIL ao configurar o pipeline. Consulte Como funciona o formato de entrada para mais informações sobre como definir este campo.

Para continuar usando o Sentieon® depois que a licença de avaliação expirar, entre em contato com support@sentieon.com.

Configurar o ambiente local e instalar pré-requisitos

1. Se você não tiver o virtualenv, execute o seguinte comando para instalá-lo usando o pip:

   pip install virtualenv

2. Execute este comando para criar um ambiente Python isolado e instalar as dependências:

   virtualenv env
   source env/bin/activate
   pip install --upgrade \
       pyyaml \
       google-api-python-client \
       google-auth \
       google-cloud-storage \
       google-auth-httplib2

Como fazer o download do script do canal

Execute o seguinte comando para fazer o download dos arquivos de exemplo e definir seu diretório atual:

git clone https://github.com/sentieon/sentieon-google-genomics.git
cd sentieon-google-genomics

Noções básicas sobre o formato de entrada

O canal usa como entrada parâmetros especificados em um arquivo JSON.

No repositório do que você fez o download, há um arquivo examples/example.json com o seguinte conteúdo:

{
  "FQ1": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_1.fastq.gz",
  "FQ2": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_2.fastq.gz",
  "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
  "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
  "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
  "PROJECT_ID": "PROJECT_ID"
  "REQUESTER_PROJECT": "PROJECT_ID",
  "EMAIL": "YOUR_EMAIL_HERE"
}

Na tabela a seguir, você verá a descrição das chaves JSON no arquivo:

Executar o canal

1. No diretório sentieon-google-genomics, edite o arquivo examples/example.json substituindo as variáveis BUCKET, REQUESTER_PROJECT, EMAIL e PROJECT_ID pelos recursos relevantes do projeto do Google Cloud:

   {
     "FQ1": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_1.fastq.gz",
     "FQ2": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_2.fastq.gz",
     "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
     "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
     "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
     "PROJECT_ID": "PROJECT_ID",
     "REQUESTER_PROJECT": "PROJECT_ID",
     "EMAIL": "EMAIL_ADDRESS"
   }

2. Defina a variável PROJECT_ID no seu ambiente:

   export PROJECT_ID=PROJECT_ID

3. Aplique o comando a seguir para executar a pipeline do DNASeq® em um pequeno conjunto de dados de teste identificado pelas entradas no arquivo de configuração. Por padrão, o script verifica se os arquivos de entrada existem no seu bucket do Cloud Storage antes de iniciar o canal.

   python runner/sentieon_runner.py --requester_project $PROJECT_ID examples/example.json

Se você especificou várias tentativas preemptivas, o pipeline é reiniciado sempre que a interrupção das instâncias é forçada. Após o término do canal, ele envia uma mensagem ao console informando se o canal foi bem-sucedido ou não.

Configuração recomendada

Para a maioria das situações, você pode otimizar o tempo de retorno e o custo usando a configuração a seguir. A configuração executa um genoma humano 30 vezes a um custo de aproximadamente US$ 1,25 e leva cerca de duas horas. Um exoma humano inteiro custa aproximadamente US$ 0,35 e leva cerca de 45 minutos. As duas estimativas são baseadas em instâncias do canal não sendo antecipadas.

{
  "FQ1": "gs://my-bucket/sample1_1.fastq.gz",
  "FQ2": "gs://my-bucket/sample1_2.fastq.gz",
  "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
  "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
  "BQSR_SITES": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.b37.vcf.gz,gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/1000G_phase1.indels.b37.vcf.gz,gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz",
  "DBSNP": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz",
  "PREEMPTIBLE_TRIES": "2",
  "NONPREEMPTIBLE_TRY": true,
  "STREAM_INPUT": "True",
  "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
  "PROJECT_ID": "PROJECT_ID",
  "EMAIL": "EMAIL_ADDRESS"
}

Outras opções

Você pode personalizar um canal usando as seguintes opções adicionais.

Opções de arquivo de entrada

O pipeline é compatível com vários arquivos fastq separados por vírgula como entrada, conforme mostrado na seguinte configuração:

"FQ1": "gs://my-bucket/s1_prep1_1.fastq.gz,gs://my-bucket/s1_prep2_1.fastq.gz",
"FQ2": "gs://my-bucket/s1_prep1_2.fastq.gz,gs://my-bucket/s1_prep2_2.fastq.gz",

O pipeline aceita arquivos BAM separados por vírgulas como entrada usando a chave JSON BAM. As leituras nos arquivos BAM não estão alinhadas ao genoma de referência. Em vez disso, elas começam no estágio de eliminação de duplicação de dados do pipeline. O seguinte exemplo mostra uma configuração que usa dois arquivos BAM como entrada:

"BAM": "gs://my-bucket/s1_prep1.bam,gs://my-bucket/s1_prep2.bam"

Dados do exoma inteiro ou grandes conjuntos de dados

As configurações da configuração recomendada são otimizadas para amostras de genoma humano completo sequenciadas para uma cobertura média de 30x. Para arquivos muito menores ou maiores que os conjuntos de dados padrão do genoma inteiro, você pode aumentar ou diminuir os recursos disponíveis para a instância. Para ter os melhores resultados com grandes conjuntos de dados, use as configurações a seguir:

{
  "FQ1": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_1.fastq.gz",
  "FQ2": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_2.fastq.gz",
  "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
  "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
  "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
  "PROJECT_ID": "PROJECT_ID",
  "EMAIL": "EMAIL_ADDRESS",
  "DISK_SIZE": 600,
  "MACHINE_TYPE": "n1-highcpu-64",
  "CPU_PLATFORM": "Intel Broadwell"
}

Na tabela a seguir, você verá uma descrição das configurações usadas:

Instâncias preemptivas

Para usar instâncias preemptivas no pipeline, configure a chave JSON PREEMPTIBLE_TRIES.

Por padrão, o executor tentará executar o canal com uma instância padrão se as tentativas preemptivas estiverem esgotadas ou se a chave JSON NONPREEMPTIBLE_TRY estiver definida como 0. Para desativar esse comportamento, defina a chave NONPREEMPTIBLE_TRY como false, conforme mostrado na seguinte configuração:

"PREEMPTIBLE_TRIES": 2,
"NONPREEMPTIBLE_TRY": false

Na tabela a seguir, você verá uma descrição das configurações usadas:

Grupos de leitura

Os grupos de leitura são adicionados quando os arquivos fastq são alinhados a um genoma de referência usando o Sentieon® BWA. É possível fornecer vários grupos de leitura separados por vírgulas. O número de grupos de leitura precisa corresponder ao número de arquivos fastq de entrada. O grupo de leitura padrão é @RG\\tID:read-group\\tSM:sample-name\\tPL:ILLUMINA. Para alterar o grupo de leitura, defina a chave READGROUP no arquivo de entrada JSON, conforme mostrado na seguinte configuração:

"READGROUP": "@RG\\tID:my-rgid-1\\tSM:my-sm\\tPL:ILLUMINA,@RG\\tID:my-rgid-2\\tSM:my-sm\\tPL:ILLUMINA"

Na tabela a seguir, você verá uma descrição da configuração usada:

Para mais informações sobre grupos de leitura, consulte Grupos de leitura.

Entrada de streaming do Cloud Storage

É possível transmitir arquivos fastq de entrada do Cloud Storage, o que pode reduzir o tempo de execução total do pipeline. Para transmitir arquivos fastq de entrada do Cloud Storage, defina a chave STREAM_INPUT JSON como True:

"STREAM_INPUT": "True"

Na tabela a seguir, você verá uma descrição da configuração usada:

Marcação duplicada

Por padrão, o canal remove leituras duplicadas de arquivos BAM. É possível alterar esse comportamento definindo a chave JSON DEDUP, conforme mostrado na seguinte configuração:

"DEDUP": "markdup"

Na tabela a seguir, você verá uma descrição da configuração usada:

Recalibragem do índice de qualidade básica (BQSR, na sigla em inglês) e sites conhecidos

O BSQR requer sites conhecidos de variação genética. O comportamento padrão é pular essa etapa do pipeline. No entanto, é possível ativar a BSQR fornecendo sites conhecidos com a chave JSON BQSR_SITES. Se fornecido, um arquivo DBSNP pode ser usado para anotar as variantes de saída durante a chamada de variantes.

"BQSR_SITES": "gs://my-bucket/reference/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.b37.vcf.gz,gs://my-bucket/reference/1000G_phase1.indels.b37.vcf.gz,gs://my-bucket/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz",
"DBSNP": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz"

Na tabela a seguir, você verá uma descrição das configurações usadas:

Intervalos

Para algumas aplicações, como sequenciamento direcionado ou exoma completo, talvez você queira apenas uma parte do genoma. Nesses casos, fornecer um arquivo de intervalos de destino pode acelerar o processamento e reduzir chamadas de variantes fora da meta e de baixa qualidade. Você pode usar intervalos com as chaves JSON INTERVAL_FILE e INTERVAL.

"INTERVAL_FILE": "gs://my-bucket/capture-targets.bed",
"INTERVAL": "9:80331190-80646365"

Na tabela a seguir, você verá uma descrição das configurações usadas:

Opções de saída

Por padrão, o pipeline produz um BAM pré-processado, métricas de controle de qualidade e chamadas variantes. É possível desativar qualquer uma dessas saídas usando as chaves JSON NO_BAM_OUTPUT, NO_METRICS e NO_HAPLOTYPER. Se o argumento NO_HAPLOTYPER não for fornecido ou for NULL, será possível utilizar a chave JSON GVCF_OUTPUT para produzir chamadas variantes no formato gVCF, em vez de no formato VCF.

"NO_BAM_OUTPUT": "true",
"NO_METRICS": "true",
"NO_HAPLOTYPER": "true",
"GVCF_OUTPUT": "true",

Na tabela a seguir, você verá uma descrição das configurações usadas:

Versões do Sentieon® DNASeq®

É possível usar qualquer versão recente do pacote de software Sentieon® DNASeq® com a API Cloud Life Sciences especificando a chave JSON SENTIEON_VERSION da seguinte maneira:

"SENTIEON_VERSION": "201808.08"

Estas versões são válidas:

• 201711.01
• 201711.02
• 201711.03
• 201711.04
• 201711.05
• 201808
• 201808.01
• 201808.03
• 201808.05
• 201808.06
• 201808.07
• 201808.08

Limpar

Depois de concluir o tutorial, limpe os recursos criados no Google Cloud para não ser cobrado por eles no futuro. Nas seções a seguir, você aprenderá a excluir e desativar esses recursos.

Exclua o projeto

A maneira mais fácil de evitar a cobrança é excluir o projeto usado no tutorial.

Para excluir o projeto, faça o seguinte:

1. No console do Google Cloud, acesse a página "Projetos".

   Acessar a página "Projetos"

2. Na lista de projetos, selecione o que você quer excluir e clique em Excluir projeto.
3. Na caixa de diálogo, digite o ID do projeto e clique em Encerrar para excluí-lo.

Próximas etapas

• Caso tenha dúvidas sobre o canal ou encontre algum problema, envie um e-mail para support@sentieon.com.